Kloning, Karakterisasi dan Overekspresi Gen carB Salmonella typhi Yang Mengkode Carbamoyl Phosphat Syntetase SubunitB

Wonohadi, Elisawati and Wahjudi, Mariana (2005) Kloning, Karakterisasi dan Overekspresi Gen carB Salmonella typhi Yang Mengkode Carbamoyl Phosphat Syntetase SubunitB. Project Report. Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Universitas Surabaya, Surabaya.

[img]
Preview
PDF
Kloning_Abstrak_2005.pdf

Download (188Kb) | Preview

Abstract

Tifus atau demam tifoid adalah golongan penyakit demam yang disebabkan oleh infeksi Salmonella typhi. Usaha penanggulangan penyakit ini melalui diagnosis, terapi dan imunisasi memerlukan pengetahuan tentang mekanisme molekular patogenitasnya serta respon sel inang terhadap Salmonella typhi. Dari penelitian sebelumnya melalui system IVET (in vivo expression technology) berhasil ditemukan gen-gen bakteri Salmonella typhimurium L T2 yang memiliki homologi dengan operon carAB E. coli K12 yaitu yang mengkode pembentukan enzim karbamoil fosfat sintetase sub urut A dan sub unit B. Kedua sub unit ini berperan dalam biosintesis arginin dan pirimidin serta diduga berperan penting terhadap proses infeksi demam mirip tifoid pada mencit dan sifat virulensi dari Salmonella typhimurium. Penelitian mengenai struktur gen car A Salmonella typhi telah dilakukan dan dilanjutkan dengan studi fungsi gen tersebut. Saat ini penelitian tentang fungsi gen carB S. typhi belum selesai dilakukan. Wahyudi M et.al. (200 I) telah berhasil melakukan amplifikasi gen carB Salmonella typhi dan melakukan kloning gen carB S. typhi tersebut menggunakan vektor pGemT dengan sel inang E. coli XL10. Pada penelitian ini akan dilakukan kloning gen carB tersebut menggunakan vektor ekspresi pET-16b dan sel inang E. coli JMI09, kemudian melakukan overekspresinya Melalui hasil penelitian ini diharapkan dapat meletakkan landasan dalam memahami mekanisme patogenitas penyakit tifus pada tingkat molekul yang diduga kuat berkaitan dengan sifat virulensi S. typhi. Kloning gen carB S. typhi diawali dengan mempersiapkan vektor pET-16b/B/N dan gen carB-11-STIB!N. Vektor pET-16b/B/N didapat dari plasmid rekombinan pET-carA-ST yang diisolasi dari biakan E. coli DH5a(pET-carA-ST) dengan melakukan pemotongan menggunakan enzim BamHI dan Ndel. Sedangkan gen carB-11-ST/B/N didapat dengan melakukan pemotongan pada plasmid rekombinan pG-carB-11-ST dari biakan E. coli XL10(pG-carB-11-ST) menggunakan enzim restriksi BamHI, setelah terpotong sempuma dilanjutkan dengan pemotongan oleh enzim Ndel. Selanjutkan setelah proses ligasi menggunakan enzim bacteriofage T4 DNA ligase dengan berbagai perbandingan vektor:insert (1:3, 1:5 dan 1:6) dilakukan proses transformasi sel E. coli JMI 09 yang telah dibuat kompeten dengan perlakuan heat shock dan larutan CaCl2 dingin. Telah dilakukan 5 kali proses transformasi dan diperoleh 369 koloni transforman. Seleksi koloni hasil transformasi dilakukan dengan memperkirakan ukuran plasmid yang diisolasi dari koloni hasil transformasi, dibandingkan dengan ukuran plasmid pET-16b sirkular. Plasmid yang memiliki ukuran lebih besar dari pET-16b sirkular merupakan plasmid yang diduga membawa DNA insert yaitu gen carB. Dari hasil analisis temyata tidak ada satupun plasmid yang memiliki ukuran lebih lebih besar dari pET-16b sirkular, dengan perkataan lain yang diduga membawa DNA insert gen carB. Disarankan wttuk melakukan pengulangan terhadap pelaksanaan kloning ini dengan menggunakan sel inang E. coli JMI09 atau dengan sel inang E. coli XLIO yang dapat digunakan untuk plasmid-plasmid berukuran sampai dengan 25 kb dan memiliki efisiensi kloning yang besar.

Item Type: Monograph (Project Report)
Uncontrolled Keywords: cloning
Subjects: Q Science > Q Science (General)
Q Science > QR Microbiology > QR355 Virology
Divisions: Faculty of Pharmacy > Department of Pharmacy
Depositing User: Eko Setiawan 194014
Date Deposited: 25 Sep 2014 02:16
Last Modified: 22 Oct 2014 03:48
URI: http://repository.ubaya.ac.id/id/eprint/20865

Actions (login required)

View Item View Item